Programes de Cribratge Poblacional

Cribratge no invasiu prenatal en sang materna (NIPT, Illumina, NGS)

El NIPT (de l'anglès, noninvasive prenatal testing) o l'estudi de l'ADN lliure circulant és una prova de cribratge per a la detecció d'aneuploïdies fetals més freqüents (trisomia 21, 18 i 13) en mostres de sang materna de gestants amb ≥10 setmanes de gestació. Fins fa pocs anys, només hi havia dues proves per a la detecció de les aneuploïdies fetals: el cribratge combinat i la realització d'una prova invasiva (amniocentesi o biòpsia de vellositats coriòniques). Els cribratges bioquímics ofereixen menor precisió i menor taxa de detecció, i els procediments invasius comporten un petit risc de pèrdua de l'embaràs (0.1%). L'ús del NIPT permet incrementar la taxa de detecció d'aquestes aneuploïdies (que pot arribar al 99,9% per a la trisomia 21) i reduir el nombre de procediments invasius (fins a un 80%).

El sistema utilitzat per a la detecció prenatal d'aneuploïdies fetals es fa mitjançant l'amplificació massiva de l'ADN fetal lliure circulant en sang materna. El protocol inclou l'ús del robot Hamilton, que permet l'anàlisis simultani de 24, 48 o 96 mostres, i la seqüenciació al NextSeq550Dx. Les dades generades s'analitzen mitjançant un programa de la casa comercial (Illumina). El risc d'aneuploïdies es valora mitjançant el càlcul de l'NCV (valor normalitzat de cada cromosoma), que compara el nombre de lectures dels cromosomes a valorar, en aquest cas els cromosomes 21, 18 i 13, respecte a uns cromosomes de referència de la mateixa mostra. Un excés en el nombre de lectures indicarà la presència d'una aneuploïdia al cromosoma determinat. A més, també s'inclou el càlcul de la fracció fetal (percentatge d'ADN d'origen fetal). L'ADN circulant és majoritàriament d'origen matern i, en menor proporció, d'origen fetal. La mida de l'ADN matern és lleugerament superior a l'ADN fetal, i això permet determinar el percentatge d'ADN fetal lliure present a la sang materna. El NIPT presenta un alt nivell de sensibilitat (>99% per a T21 i >98% per a T18 i T13) i especificitat (~99.9 % per les 3 trisomes), superiors als del cribratge combinat tradicional.

Inclusió de proves de segon nivell al Programa de Cribratge Neonatal mitjançant cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS)

Les proves de segon nivell són proves addicionals específiques que es realitzen a la mostra inicial de sang impregnada en paper d'aquells nounats que hagin presentat un resultat alterat al cribratge. Només en cas que en aquest estudi addicional s'obtingui un resultat inicial alterat serà realment necessari dur a terme accions per identificar o descartar una malaltia.

La inclusió d'aquesta estratègia al Programa de Cribratge Neonatal de Catalunya ha augmentat l'eficiència del Programa, incrementant el valor predictiu positiu a un 95% i reduint la taxa de falsos positius a menys d'un 0,001%. Això suposa una disminució del nombre de sol·licitud de segones mostres a les famílies, i del nombre de nadons derivats a les unitats clíniques de referència per confirmar/descartar la sospita, fet que es tradueix en una reducció de l'ansietat i l'estrès generat a les famílies. També la inclusió de proves de segon nivell redueix la probabilitat de tenir falsos negatius. Som pioners en la inclusió d'aquestes proves a nivell nacional, per a 15 de les 26 malalties incloses al nostre panell. Aquestes proves inclouen exemples serien la determinació d’un panell de 28 metabòlits que inclouen diferents àcids orgànics, isòmers d’acilglicines i acilcarnitines i la determinació de 48 aminoàcids (per la detecció de les malalties metabòliques hereditàries, la mesura de la proteïna associada a pancreatitis (PAP), per a la detecció de fibrosi quística i la determinació d’un perfil d’esteroides per la detecció de la hiperplàsia suprarenal congènita.

 
Quantificació de Cercles d'Escissió del Gen del Receptor de Limfòcits T (TRECs) en sang impregnada en paper

Els TRECs (de l'anglès, T-cell Receptor Excision Circles) són el biomarcador emprat per al cribratge neonatal de la immunodeficiència combinada greu (IDCG). Els TRECs són molècules d'ADN circulars estables formades pel reordenament del gen del receptor del limfòcit T durant la seva diferenciació en el timus, sent un marcador de limfòcits T recentment formats (aquesta població cel·lular està extremadament disminuïda en la majoria dels nadons amb una IDCG). La quantificació de TRECs a la sang impregnada en paper (discos de 3.2 mm de diàmetre) es realitza amb el kit Eonis SCID-SMA (Revvity). Aquesta metodologia consisteix en una amplificació d'àcids nucleics mitjançant PCR quantitativa.

La realització d'aquesta prova està indicada com a prova ràpida davant la sospita d'una immunodeficiència primària, especialment en el cas d'IDCG, així com per al seguiment del tractament amb trasplantament de progenitors hematopoètics en aquests pacients.

Analitzador automàtic per a la determinació quantitativa de sang oculta en femta

La metodologia emprada és la immunoturbidimetria a partir de l'aglutinació de partícules de làtex unides a anticossos que detecten de manera específica l'hemoglobina humana. L'analitzador automàtic emprat assoleix un flux de treball de 320 determinacions/hora.< /p>

LLa prova immunoquímica de detecció de sang oculta en femta és l'única que ha demostrat la seva eficàcia en assaigs controlats aleatoritzats (nivell d'evidència 1, grau de recomanació A). En estudis europeus poblacionals, la reducció de la mortalitat per càncer colorectal ha estat del 15-18%, si bé s'estima que aquesta reducció pot arribar fins al 30%. La sensibilitat d'aquesta prova varia entre el 85 i el 95% i l'especificitat pot assolir el 94%. 

Cromatografia líquida acoblada a l'espectrometria de masses en tàndem

La cromatografia líquida acoblada a l'espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS) és una potent tècnica analítica presenta grans avantatges permetent analitzar amb molt poca quantitat de mostra un ampli espectre de compostos en temps curts, que alhora es poden identificar i quantificar amb una gran selectivitat, sensibilitat i especificitat. Així, la LC-MS/MS ens permet quantificar diversos biomarcadors per al diagnòstic i la monitorització del tractament de més de 500 entitats genètiques. La seva implementació ha permès substituir tècniques radiomètriques, obtenint la mateixa sensibilitat i una millor especificitat, així com eliminar tècniques obsoletes que requerien una gran quantitat de volum de mostra. Finalment, l'aplicació d'aquesta tecnologia ens ha permès ampliar el cribratge neonatal de Catalunya de 3 a 20 malalties, tot i que poden detectar-se fins a 60 per diagnòstic diferencial